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生活飲用水中大腸埃希氏菌檢驗方法及結果分析

張輝
錄入時間:2022-2-18 14:41:38 來源:青島海博生物

一、大腸埃希氏菌情況簡要介紹

  大腸埃希氏菌(Escherichia coli,E. coli)為埃希氏菌屬(Escherichia)代表菌。一般多不致病,廣泛存在于人和溫血動物的腸道中。

  大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性短桿菌,大小0.5×1~3微米。周生鞭毛,能運動,無芽孢。能發酵多種糖類產酸、產氣,是人和動物腸道中的正常棲居菌,嬰兒出生后即隨哺乳進入腸道,與人終身相伴,幾乎占糞便干重的1/3。國家規定,每毫升飲用水中的菌落總數小于100,每100毫升水中不得檢出總大腸菌群。


二、參考標準

  《GBT5750.12-2006生活飲用水標準檢驗方法微生物指標:大腸埃希氏菌》點擊下載


三、檢驗方法以及結果分析

  3.1大腸埃希氏菌多管發酵法

  大腸埃希氏菌多管發酵法是指多管發酵法總大腸菌群陽性,在含有熒光底物的培養基上44.5℃培養24 h產生葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase),分解熒光底物釋放出熒光產物,使培養基在紫外光下產生特征性熒光的細菌,以此來檢測水中大腸埃希氏菌的方法。

  3.1.1 檢驗步驟

  3.1.1.1 乳糖發酵試驗

  (1)取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養液中,取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中,另取1mL水樣注入到9mL滅菌生理鹽水中,混勻后吸取1mL(即0.1mL水樣)注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中,每一稀釋度接種5管。

  對已處理過的出廠自來水,需經常檢驗或每天檢驗一次的,可直接種5份10mL水樣雙料培養基,每份接種10mL水樣。

  檢驗水源水時,如污染較嚴重,應加大稀釋度,可接種1、0.1、0.01mL甚至0.1、0.01、0.001mL,每個稀釋度接種5管,每個水樣共接種15管。接種1mL以下水樣時,必須作10倍遞增稀釋后,取1mL接種,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌刻度吸管。

(2)將接種管置36℃±1℃培養箱內,培養24h±2h。如有產酸產氣者,則按下列步驟進行。

圖1 乳糖蛋白胨培養基微生物質控結果

  3.1.1.2 EC-MUG培養基試驗

  用燒灼滅菌的金屬接種環或無菌棉簽將上述試管中液體接種到EC-MUG管中。將已接種的EC-MUG管在培養箱或恒溫水浴中44.5℃±0.5℃培養24h±2h。如使用恒溫水浴,在接種后30min內進行培養,使水浴的液面超過EC-MUG管的液面。

  3.1.2 結果觀察與報告

  將培養后的EC-MUG管在暗處用波長為366nm功率為6W的紫外光燈照射,如果有藍色熒光產生則表示水樣中含有大腸埃希氏菌。

圖2 EC-MUG培養基微生物質控結果

 ; 計算EC-MUG陽性管數,查對應的最可能數(MPN)表(表1或表2)得出大腸埃希氏菌的最可能數,結果以MPN/100mL報告。

表1 大腸埃希氏菌(MPN)檢索表(部分)

(總接種量55.5mL,其中5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣)

表2 用5份10 mL水樣時各種陽性和陰性結果組合時的最可能數(MPN)

  3.2大腸埃希氏菌濾膜法

  用濾膜法檢測水樣后,將總大腸菌群陽性的濾膜在含有熒光底物的培養基上培養,能產生β-葡萄糖醛酸酶分解熒光底物釋放出熒光產物,使菌落能夠在紫外光下產生特征性熒光,以此來檢測水中大腸埃

  3.2.1 檢驗步驟

  (1)準備工作

  濾膜滅菌:將濾膜放入燒杯中,加入蒸餾水,置于沸水浴中煮沸滅菌3次,每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2次~3次,以除去殘留溶劑。

  濾器滅菌:用點燃的酒精棉球火焰滅菌。也可用蒸汽滅菌器103.43kPa(121℃)高壓滅菌20min。

  (2)過濾水樣

  用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分,將粗糙面向上,貼放在已滅菌的濾床上,固定好濾器,將100mL水樣(如水樣含菌數較多,可減少過濾水樣量,或將水樣稀釋)注入濾器中,打開濾器閥門,在-5.07×104Pa(負0.5大氣壓)下抽濾。

  (3)培養

  水樣濾完后,再抽氣約5s,關上濾器閥門,取下濾器,用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分,移放在品紅亞硫酸鈉培養基上,濾膜截留細菌面向上,濾膜應與培養基完全貼緊,兩者間不得留有氣泡,然后將平皿倒置,放入37℃恒溫箱內培養24h±2h。

  (4)接種

  挑取符合下列典型菌落生長的濾膜進行大腸埃希氏菌檢測。

  紫紅色、具有金屬光澤的菌落;

  深紅色、不帶或略帶金屬光澤的菌落;

  淡紅色、中心色較深的菌落。

圖3 質控菌株在品紅亞硫酸鈉培養基生長情況

注:A:大腸埃希氏菌ATCC 25922;B:大腸埃希氏菌ATCC 8739;C:弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864;

D:鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028;E:糞腸球菌ATCC 29212;

  在無菌操作條件下將濾膜轉移到NA-MUG平板上,細菌截留面朝上,進行培養。將已接種的NA-MUG平板36℃±1℃培養4 h。

  3.2.2 結果觀察與報告

  將培養后的NA-MUG平板在暗處用波長為366nm功率為6W的紫外光燈照射,如果菌落邊緣或菌落背面有藍色熒光產生則表示水樣中含有大腸埃希氏菌。

圖4 質控菌株在NA-MUG培養基生長情況

注:A:大腸埃希氏菌ATCC 25922;B:大腸埃希氏菌ATCC 8739;

C:大腸埃希氏菌CMCC(B) 44102;D:鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028;

 ; 記錄有藍色熒光產生的菌落數,按下列公式計算濾膜上生長的大腸埃希氏菌數,以每100mL水樣中的大腸埃希氏菌(CFU/100mL)報告。

  3.3大腸埃希氏菌酶底物法

  在選擇性培養基上能產生β-半乳糖甘酶(β-D-galactosidase)分解色原底物釋放出色原體使培養基呈現顏色變化,并能產生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)分解熒光底物釋放出熒光產物,使菌落能夠在紫外光下產生特征性熒光;以此技術來檢測大腸埃希氏菌的方法為大腸埃希氏菌酶底物法。

  3.3.1 檢驗步驟

  (1)水樣稀釋

  檢測所需水樣為100mL。若水樣污染嚴重,可對水樣進行稀釋。取10mL水樣加入到90mL滅菌生理鹽水中,必要時可加大稀釋度。

  (2)定性反應

  用100mL的無菌稀釋瓶量取100mL水樣,加入2.7g±0.5g的MMO-MUG培養基粉末,混搖均勻使之完全溶解后,放入36℃±1℃的培養箱內培養24h。

  (3)10管法

  用100mL的無菌稀釋瓶量取100mL水樣,加入2.7g±0.5g的MMO-MUG培養基粉末,混搖均勻使之完全溶解。

準備10支15mm×10cm或適當大小的滅菌試管,用無菌吸管分別從前述稀釋瓶中吸取10mL水樣至各試管中,放入36℃±1℃的培養箱中培養24h。

  (4)51孔定量盤法

  用100mL的無菌稀釋瓶量取100mL水樣,加入2.7g±0.5g的MMO-MUG培養基粉末,混搖均勻使之完全溶解。

將前述100mL水樣全部倒入51孔無菌定量盤內,以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內氣泡,然后用程控定量封口機封口。放入36℃±1℃的培養箱中培養24h。

圖5 51孔定量盤

  3.3.2 結果報告

  (1)結果判讀

  將水樣培養24h后進行結果判讀,如果結果為可疑陽性,可延長培養時間到28h進行結果判讀,超過28h之后出現的顏色反應不作為陽性結果。

  對照表同表3與表4,水樣變黃色同時有藍色熒光判斷為大腸埃希氏菌陽性,水樣未變黃色而有熒光產生不判定為大腸埃希氏菌陽性。

圖6 質控菌株在MMO-MUG培養基中生長情況

A:大腸埃希氏菌ATCC 25922;B:陰溝腸桿菌ATCC 23355;C:弗氏檸檬鹽桿菌ATCC 43864;

D:肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031;E:鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028;

  (2)定性反應

  將經過24h培養顏色變成黃色的水樣在暗處用波長為366nm的紫外光燈照射,如果有藍色熒光產生判斷為陽性反應,表示水中含有大腸埃希氏菌。水樣未產生藍色熒光判斷為陰性反應。結果以大腸埃希氏菌檢出或未檢出報告。

  (3)10管法

  將培養24h顏色變成黃色的水樣的試管在暗處用波長為366nm的紫外光燈照射,如果有藍色熒光產生則表示有大腸埃希氏菌存在。

  計算有熒光反應的試管數,對照表3查出其代表的大腸埃希氏菌最可能數。結果以MPN/100mL表示。如所有管未產生熒光,則可報告為大腸埃希氏菌未檢出。

表3 10管法不同陽性結果的最可能數(MPN)及95%可信范圍(部分)

  (4)51孔定量盤法

  將培養24h顏色變成黃色的水樣的定量盤在暗處用波長為366nm的紫外光燈照射,如果有藍色的熒光產生則表示該定量盤孔穴中含有大腸埃希氏菌。

  計算有熒光反應的孔穴數,對照表4查出其代表的大腸埃希氏菌最可能數。結果以MPN/100mL表示。如所有孔未產生熒光,則可報告為大腸埃希氏菌未檢出。

表4 51孔定量盤法不同陽性結果的最可能數(MPN)及95%可信范圍(部分)


GBT5750.12-2006 生活飲用水標準檢驗方法微生物指標 -標準下載

http://www.tokoserambi.com/biaozhun-download.asp?id=166


注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。

 

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